Background: The pandemic of the new coronavirus infection, COVID-19, is currently ongoing in the world. Over the years, the pathogen, SARS-CoV-2, has undergone a series of mutational genome changes, which has led to the spread of various genetic variants of the virus. Meanwhile, the methods used to diagnose SARS-CoV-2, to establish the disease stage and to assess the immunity, are nonspecific to SARS-CoV-2 variants and time-consumable. Thus, the development of new methods for diagnosing COVID-19, as well as their implementation in practice, is currently an important direction. In particular, application of systems based on chemically modified fluorescent microspheres (with a multiplex assay for target protein molecules) opens great opportunities.
Aim: development of a microfluidic diagnostic test system based on fluorescent microspheres for the specific detection of immunoglobulins G (IgG) to SARS-CoV-2.
Methods: A collection of human serum samples was characterized using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and commercially available reagent kits. IgG to SARS-CoV-2 in the human serum were detected by the developed immunofluorescent method using microspheres containing the chemically immobilized RBD fragment of the SARS-CoV-2 (“Kappa” variant) viral S-protein.
Results: The level of IgG in the blood serum of recovered volunteers was 9-300 times higher than that in apparently healthy volunteers, according to ELISA (p<0.001). Conjugates of fluorescent microspheres with the RBD-fragment of the S-protein, capable of specifically binding IgG from the blood serum, have been obtained. The immune complexes formation was confirmed by the fluorescence microscopy data; the fluorescence intensity of secondary antibodies in the immune complexes formed on the surface of microspheres was proportional to the content of IgG (r 0.963). The test system had a good predictive value (AUC 70.3%).
Conclusion: A test system has been developed, based on fluorescent microspheres containing the immobilized RBD fragment of the SARS-CoV-2 S-protein, for the immunofluorescent detection of IgG in the human blood serum. When testing the system on samples with different levels of IgG to SARS-CoV-2, its prognostic value was shown. The obtained results allow us to present the test system as a method to assess the level of immunoglobulins to SARS-CoV-2 in the human blood serum for the implementation in clinical practice. The test system can also be integrated into various microfluidic systems to create chips and devices for the point-of-care diagnostics.
Обоснование. С 2019 года весь мир охватила пандемия новой коронавирусной инфекции COVID-19, которая продолжается по сей день. За эти годы возбудитель SARS-CoV-2 претерпел ряд мутационных изменений в геноме, что повлекло распространение различных генетических вариантов вируса. Между тем для диагностики этиологического агента, установления стадии заболевания и оценки иммунитета используются методы, неспецифичные в отношении различных вариантов SARS-CoV-2 и требующие значительных временных затрат. Таким образом, актуальным направлением является разработка новых методов диагностики COVID-19, а также внедрение данных разработок в практику. Широкие возможности в этом направлении открывают системы на основе химически модифицированных флюоресцентных микросфер с возможностью мультиплексного анализа целевых белковых молекул.
Цель исследования — разработка микрофлюидной тест-системы на основе флюоресцентных микросфер для специфического обнаружения иммуноглобулинов класса G (IgG) к SARS-CoV-2.
Методы. Формирование охарактеризованной коллекции образцов сыворотки крови человека с использованием иммуноферментного анализа и коммерчески доступных наборов реагентов. Обнаружение IgG к SARS-CoV-2 в сыворотке крови человека, содержащей известный уровень антител, разработанным иммунофлюоресцентным методом с использованием микросфер, на поверхности которых химическим путем был иммобилизован RBD-фрагмент S-белка вируса SARS-CoV-2, вариант Каппа.
Результаты. Согласно данным иммуноферментного анализа, уровень IgG в сыворотке крови добровольцев в группе, перенесших коронавирусную инфекцию, в 9–300 раз превышал таковой в группе условно здоровых добровольцев, не болевших COVID-19. Получены конъюгаты флюоресцентных микросфер с RBD-фрагментом S-белка, способные специфически связывать IgG из сыворотки крови. Образование иммунных комплексов подтверждено данными флюоресцентной микроскопии: интенсивность флюоресценции вторичных антител в иммунных комплексах при их образовании на поверхности флюоресцентных микросфер прямо пропорциональна содержанию IgG (r=0,963). Тест-система обладает хорошей прогностической значимостью (AUC 70,3%).
Заключение. Разработана тест-система на основе флюоресцентных микросфер, содержащих иммобилизованный RBD-фрагмент S-белка SARS-CoV-2, для иммунофлюоресцентного выявления IgG в сыворотке крови человека. При апробации системы на образцах сыворотки крови добровольцев с различным уровнем IgG к SARS-CoV-2 показана ее прогностическая ценность, что позволяет позиционировать представленную тест-систему как метод оценки содержания иммуноглобулинов к SARS-CoV-2 в сыворотке крови человека с перспективой внедрения в клиническую практику. Представленная тест-система может быть использована также для интеграции в различные микрофлюидные системы и создания чипов и приборов «прикроватной диагностики».