BACKGROUND: Invasive aspergillosis is a threatening fungal infection with high mortality rates. One of the key factors for timely diagnostics of the disease is an approach based on detection of galactomannan, a polysaccharide from the pathogen’s cell wall. The existing galactomannan enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) employ the colorimetric detection. The emergence of the new highly sensitive techniques for the measurement of peroxidase label in ELISA, e.g., based on the effect of surface-enhanced Raman scattering (SERS), facilitates the development of a next generation assays with improved sensitivity and with potentially broader range of biological fluids applicable for analysis. An important step of developing the new test-system is the demonstration of its applicability to real clinical samples and comparability of the results with reference method. AIM: To evaluate the applicability of the previously developed highly sensitive and selective SERS-based ELISA protocol for the measurement of Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid samples. METHODS: Ten bronchoalveolar lavage fluid samples were analyzed using both the GalMAg-EIA ELISA kit (XEMA LLC, Russia) and the previously developed SERS-based ELISA, which employs o-phenylenediamine substrate and silver nanoparticles colloid. RESULTS: Using standard samples prepared with in vitro cultivated galactomannan, the limit of detection for the SERS-based ELISA was estimated as 53 pg/mL with the working range spanning up to 10.8 ng/mL and the mean coefficient of variation within this range being 4%. Using the GalMAg-EIA kit, 6 out of 10 bronchoalveolar lavage fluid samples were identified as positive and 4 — as negative. The comparison of the results for these two methods demonstrates the non-linear dependence with the Spearman coefficient of correlation being 0.93–0.95 (p=2.3×10-5–1.1×10-4). CONCLUSION: For the bronchoalveolar lavage fluid samples, the comparability of the results was demonstrated when detecting the galactomannan using the commercially available GalMAg-EIA kit and the previously developed SERS-based ELISA. The results confirm the high sensitivity of the SERS-based Aspergillus galactomannan ELISA and its prospectiveness for practical laboratory applications. Compared to chromogenic detection, the advantages of surface-enhanced Raman scattering readout include a lower limit of detection for galactomannan and increased sensitivity at the lower end of the galactomannan-positivity index (<2). These findings could enable more accurate determination of the threshold for discriminating the positive and the negative samples. Thus, the research provides the basis for future larger scale trials of the SERS-based galactomannan ELISA in order to evaluate its applicability for clinical-laboratory diagnostics.
Обоснование. Инвазивный аспергиллёз является опасной грибковой инфекцией с высокой статистикой смертности. Одним из ключевых факторов своевременной диагностики заболевания является подход, основанный на обнаружении галактоманнана — полисахарида клеточной стенки возбудителя. Существующие иммуноферментные (ИФА) тест-системы для определения галактоманнана используют колориметрический метод регистрации. Появление новых высокочувствительных методик для измерения пероксидазной метки в иммуноферментном анализе, основанных, в частности, на эффекте гигантского комбинационного рассеяния (ГКР), открывает возможности для создания нового поколения тест-систем с улучшенной чувствительностью и потенциально более широким спектром пригодных для анализа биологических жидкостей. Важным этапом разработки новой тест-системы является демонстрация возможности измерений реальных клинических образцов и сравнение полученных результатов с референтным методом. Цель исследования — изучить применимость ранее разработанного высокочувствительного и селективного протокола иммуноферментного анализа, использующего детекцию сигнала методом гигантского комбинационного рассеяния, для определения галактоманнана Aspergillus в смывах с поверхности слизистой оболочки трахеи и бронхов, полученных с помощью процедуры бронхоальвеолярного лаважа. Методы. Десять образцов бронхоальвеолярного лаважа были проанализированы с помощью набора реагентов «GalMAg-ИФА» (ХЕМА, Россия), а также разработанного ранее метода иммуноферментного анализа с ГКР-детекцией, использующего субстрат о-фенилендиамин и золь наночастиц серебра. Результаты. Для калибровочных образцов, содержащих культуральный галактоманнан, предел обнаружения методики иммуноферментного анализа с ГКР-детекцией составил 53 пг/мл с рабочим диапазоном до 10,8 нг/мл и средним коэффициентом вариации в рабочем диапазоне 4%. C помощью набора реагентов «GalMAg-ИФА» 6 из 10 образцов бронхоальвеолярного лаважа были идентифицированы как положительные, 4 — как отрицательные. Сопоставление результатов двух методов демонстрирует нелинейную зависимость с коэффициентом корреляции Спирмена 0,93–0,95 (p=2,3×10-5–1,1×10-4). Заключение. Для образцов бронхоальвеолярного лаважа продемонстрирована сопоставимость результатов при определении галактоманнана с помощью коммерческого набора «GalMAg-ИФА» и разработанного иммуноферментного анализа с ГКР-детекцией. Полученные результаты свидетельствуют, что предложенный протокол иммуноферментного анализа с ГКР-детекцией для определения галактоманнана Aspergillus обладает высокой чувствительностью и является перспективным для применения в лабораторной практике. Преимуществом регистрации методом ГКР по сравнению с хромогенной детекцией являются снижение предела обнаружения галактоманнана и увеличение чувствительности в области низких значений индекса позитивности (<2), что в будущем может позволить более точно определить порог разграничения положительных и отрицательных результатов. Таким образом, исследование предоставляет обоснование для испытаний предлагаемого протокола на большей выборке с целью получения заключения о возможности использования его в клинико-лабораторной диагностике.