Background: Different species of Campylobacter are the most common cause of bacterial gastroenteritis. There are many methods to detect the presence of Campylobacter, including PCR, but it takes no less than 5 -6 hours. Development of fast molecular diagnostic tests based on a loop-mediated amplification assay will allow simplifying the procedure and reducing the time of detection for a bedside application.
Aims: To develop a loop-mediated isothermal amplification assay (LAMP) with a fluorescent probe for the diagnosis of campylobacteriosis.
Methods: Stool suspensions were prepared and bacterial fractions were separated as described in the methodological recommendations of the Central Research Institute of Epidemiology. DNA was extracted using AmpliTest RIBO-prep (FSBI SPC FMBA, Russian Federation) according to the manufacturer's instruction and detected with AmpliSens® OKI-screen-FL (FBIS CRIE, Russian Federation). Primers and probes were selected in a 16S rDNA gene region. Analytical specificity was confirmed on bacterial cultures, analytical sensitivity was assessed using a recombinant plasmid containing the target Campylobacter DNA sequence fragment. LAMP amplification was performed at 65°C for 30 min.
Results: An assay for the detection of Campylobacter spp. based on loop-mediated isothermal amplification has been developed, the reaction time does not exceed 30 minutes. The analytical sensitivity of the developed technique is comparable to the real-time PCR and is equal to 103 copies/ml, the analytical specificity is 100%. The evaluation of 127 clinical samples, previously characterized by a commercial kit, AmpliSens® OKI-screen-FL (FBIS CRIE, Russian Federation), showed high diagnostic specificity and sensitivity of the developed LAMP-method. No false positive results were found, 108 samples were negative by LAMP and PCR. Campylobacter spp. DNA was detected by the LAMP method in 18 out of 19 PCR-positive samples. One discordant LAMP negative sample can be attributed to the low bacterial load of Campylobacter spp. for a given sample. Conclusions: A method for the rapid detection of Campylobacter spp. loop-mediated isothermal amplification has been developed, and its high analytical and diagnostic characteristics have been shown experimentally.
Обоснование. Среди бактерий представители Campylobacter spp. часто становятся причиной гастроэнтеритов. Для их выявления активно используются различные диагностические методы, в том числе метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), однако для получения результатов требуется не менее 5–6 ч. Разработка быстрых молекулярных диагностических тестов на основе петлевой изотермической амплификации позволит существенно упростить процедуру и сократить время исследования, приблизив их к формату «у постели больного».
Цель исследования — разработка методики, основанной на петлевой изотермической амплификации (LAMP) с детектирующим флуоресцентным зондом, для диагностики кампилобактериоза.
Методы. Предварительную пробоподготовку клинических образцов фекалий проводили согласно методическим рекомендациям ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Экстрагировали ДНК с помощью набора «АмплиТест РИБО-преп» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Присутствие Campylobacter spp. подтверждали методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора «АмплиСенс® ОКИ-скрин-FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия). В качестве гена-мишени для выбора LAMP-праймеров использовали ген 16S рРНК. Аналитическую специфичность проверяли на культурах бактерий; аналитическую чувствительность оценивали с помощью рекомбинантной плазмиды, содержащей целевой фрагмент последовательности ДНК кампилобактерий. Изотермическую амплификацию проводили при температуре 65°C в течение 30 мин.
Результаты. Разработана методика для выявления Campylobacter spp. на основе петлевой изотермической амплификации, где время реакции не превышает 30 мин. Аналитическая чувствительность разработанной методики сравнима с показателями ПЦР и равна 103 ГЭ/мл; аналитическая специфичность составляет 100%. Исследование 127 клинических образцов, предварительно охарактеризованных коммерческим набором «АмплиСенс® ОКИ-скрин-FL», показало высокую диагностическую специфичность и чувствительность разработанной LAMP-методики. Ложноположительных результатов не выявлено, 108 образцов оказались отрицательными по результатам LAMP и ПЦР. ДНК Campylobacter spp. была обнаружена методом LAMP в 18 образцах из 19 положительных по результатам ПЦР. Один дискордантный образец, отрицательный по результатам LAMP, может быть объяснен низкой бактериальной нагрузкой Campylobacter spp. для данного образца.
Заключение. Разработана методика быстрого выявления Campylobacter spp. на основе изотермической амплификации, и экспериментально показаны ее высокие аналитические и диагностические характеристики.