Дифференциальная диагностика немелкоклеточного и мелкоклеточного рака легкого: краткий обзор современных подходов и перспективных технологий



Цитировать

Полный текст

Аннотация

Рак легкого (РЛ) представляет собой гетерогенную группу злокачественных новообразований, среди которых выделяют две основные формы: немелкоклеточный (НМРЛ) и мелкоклеточный рак легкого (МРЛ). Эти подтипы существенно различаются по гистологическим, молекулярно-генетическим и клиническим характеристикам, что определяет необходимость точной дифференциальной диагностики для выбора оптимальной тактики лечения.

В этом обзоре рассмотрены современные методы диагностики НМРЛ и МРЛ, включая инструментальную диагностику, гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Особое внимание уделено плюсам и минусам перспективных не- и малоинвазивных подходов, таких как анализ циркулирующих опухолевых клеток, внеклеточной ДНК, микроРНК, белковых маркеров, летучих органических соединений, современной медицинской визуализации (радиомика).

Несмотря на значительные успехи в разработке новых диагностических подходов, сохраняются проблемы, связанные с гетерогенностью опухолей, ограниченной доступностью материала МРЛ и необходимостью стандартизации новых методов. Перспективным направлением представляется интеграция мультимодальных подходов, сочетающих жидкостную биопсию, радиомику и алгоритмы машинного обучения, которая может повысить точность диагностики и оптимизировать персонализированное лечение пациентов с различными подтипами РЛ.

Полный текст

1.Введение

Рак легкого (РЛ) – гетерогенная группа злокачественных новообразований, различающихся по гистогенезу, молекулярно-генетическому профилю, клиническому течению и подходам к терапии. Источником опухолевого роста служат клетки покровного эпителия слизистой оболочки бронхов, бронхиальных слизистых желез бронхиол и легочных альвеол [1]. РЛ занимает по смертности 1-е место среди мужчин и 2-ое среди женщин как в России, так и в мире, по распространенности среди мужчин также 1-е, а среди женщин – 2-ое и 5-ое в мире и в России, соответственно [2, 3]. Суммарно РЛ остается основной причиной смерти от рака с приблизительной статистикой в 2,48 миллиона новых случаев и 1,84 миллиона смертей ежегодно [3], несмотря на снижение смертности от РЛ в целом за последние 10 лет [4]. В то же время, хотя частота заболеваемости РЛ среди мужчин выше, чем среди женщин, наблюдаются одновременно две тенденции - ее снижения среди мужчин и повышения среди женщин [5]. Снижение заболеваемости среди мужчин напрямую связано со снижением частоты курения. В то же время, заболеваемость женщин повышается в большей степени среди некурящих и в возрасте старше 60 лет [6]. Женщины более склонны к развитию РЛ, не связанного с курением. Исследователи связывают это с межполовыми различиями частоты мутаций рецептора эпидермального фактора роста, киназы анапластической лимфомы и гена гомолога вирусного онкогена саркомы крыс Кирстен (KRAS)  [7, 8].

 

Классификация РЛ основана на гистологическом типе опухоли и имеет принципиальное значение для диагностики, прогноза и выбора тактики лечения. В международной клинической практике наиболее широко используется классификация ВОЗ и деление на две основные группы: немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ, к которому относится наиболее распространенная аденокарцинома, а также плоскоклеточный и крупноклеточный подтипы) и мелкоклеточный рак легкого (МРЛ, Рис.1).

Рис 1. Классификация РЛ [9]

Fig. 1. Lung cancer types

МРЛ и НМРЛ значительно различаются по происхождению, взаимосвязи с курением, течению, прогнозу, эффективному лечению (Таблица 1). 

Таблица 1. Немелкоклеточный (НМРЛ) и мелкоклеточный (МРЛ) рак легкого: ключевые различия  

Table 1. Non-small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer (SCLC): key differences

 

НМРЛ

МРЛ 

литературный источник

Частота встречаемости

86-89%  у мужчин и 90-93%  у женщин

11-14% у мужчин и 7-10% у женщин*

[10-12]

Происхождение

Аденокарцинома - железистые клетки, продуцирующие слизь

Плоскоклеточный рак - эпителиальные клетки

Нейроэндокринные клетки базального эпителия бронхов

[1, 13, 14]

Расположение и особенности

Чаще встречается в периферической зоне (особенно аденокарцинома), реже — в центральной (чаще плоскоклеточный рак).Опухолевые клетки имеют признаки злокачественной трансформации эпителия

Центральная опухоль, возникающая из подслизистой оболочки дыхательных путей в виде перигилярной массы. Клетки представляют собой небольшие веретенообразные или круглые клетки со скудной цитоплазмой, зернистым хроматином, и часто наблюдается некроз

[13-15

Связь с курением

~84% случаев (аденокарцинома может быть у некурящих)

>96% случаев

[16]

Подтипы

Аденокарцинома, плоскоклеточный, крупноклеточный.

Чистый МРЛ, комбинированный (с элементами НМРЛ)

[1]

Типичные мутации

EGFR, KRAS, ALK, ROS1

Потеря TP53 и RB1 

[17-22]

Течение

Медленный рост, позднее метастазирование

- Агрессивный, раннее метастазирование (в мозг, печень).  

[1]

Лечение

- Хирургия на ранних стадиях.

-Химиотерапия на II, III стадиях и иногда на стадии В

- Лучевая терапия  

  - Таргетная терапия (ингибиторы EGFR, ALK).  

  - Иммунотерапия (PD-1/PD-L1).  

Хирургическое лечение редко применяется из-за раннего метастазирования, только для стадии I (IА и IВ) и в отдельных случаях при стадии II с обязательной адъювантной ХТ  

 - Системная химиотерапия (этопозид + платина) + иммунотерапия (атезолизумаб)+ радиотерапия (опционально).  

  - быстрое развитие резистентности к химиотерапии (часто связанное с потерей TP53/RB1) 

[2, 14]

Прогноз

Лучше (5-летняя выживаемость ~32% суммарно по всем стадиям) 

Хуже (5-летняя выживаемость <9% суммарно по всем стадиям) 

[23]

Паранеопластичес-кие синдромы

Редко 

Часто (SIADH, синдром Кушинга)

[24]

 

МРЛ является агрессивной, быстро растущей опухолью, которая часто метастазирует в печень, мозг, кости и, хотя изначально чувствительна к химио- и радиотерапии, но нередко быстро развивается резистентность с последующим возникновением рецидивов. В связи с этим, своевременная дифференциальная диагностика НМРЛ и МРЛ является важной задачей современной медицины.

2. Дифференциальная диагностика НМРЛ и МРЛ в условиях современной клиники

В современной клинической практике дифференциальная диагностика  МРЛ и НМРЛ выполняется комплексно, с использованием следующих методов: рентгенография, КТ, ПЭТ-КТ, бронхологическое исследование с последующими гистологической и иммуногистохимической диагностикой (основной метод), с молекулярно-генетическим тестированием для НМРЛ. Клинические показания для проведения этих исследований включают следующие симптомы: кашель, затруднение дыхания, одышка, боль в груди, хрипы, кровохарканье, слабость, утомляемость, снижение аппетита, частые инфекции органов грудной клетки, постоянные боли в грудной клетке, плечах, охриплость или понижение голоса, необъяснимая потеря веса  [2, 14].

Методы диагностической визуализации

Методы диагностической визуализации включают в себя рентгенографию, КТ, ПЭТ-КТ. Рентгенография органов грудной клетки не рекомендуется в качестве популяционного скрининга РЛ, поскольку проспективные рандомизированные исследования не выявили достоверного снижения смертности от РЛ при использовании этой методики как скрининговой. Чувствительность рентгенографии для выявления ранних стадий РЛ составляет менее 50%, поэтому при подозрении на опухоль обязательна КТ. Однако, рентгенография по-прежнему является основной методикой выявления первичного подозрения на РЛ при имеющихся клинических показаниях. Для дальнейшей оценки патологических изменений, установленных при рентгенографии, используют КТ/КТ-исследование с внутривенным болюсным контрастированием [2].

Хотя точный подтип РЛ с помощью КТ установить невозможно, тем не менее существуют косвенные признаки, характерные для МРЛ, к которым относится центральное расположение опухоли с массивным средостенным лимфаденопатитом, а также быстрый рост и раннее метастазирование. В то же время НМРЛ может быть как периферическим (аденокарцинома), так и центральным (плоскоклеточный) и, как правило, медленнее прогрессирует. 

Оценка метаболической активности с помощью радиофармпрепарата (обычно ¹F-ФДГ) основана на свойстве злокачественных опухолей активно поглощать глюкозу, что помогает отличить их от доброкачественных изменений (гранулемы, рубцы). Чувствительность ПЭТ-КТ для выявления злокачественных узлов >90%, специфичность — 70-85% (ложноположительные результаты возможны при воспалении или инфекциях). Этот метод позволяет установить стадию развития  опухолевого процесса, классифицировать по системе TNM, выявить метастазы. При этом МРЛ обычно демонстрирует высокий SUVmax по сравнению с НМРЛ. Дополнительным преимуществом точного определения границ опухоли с помощью  ПЭТ-КТ является возможность  оптимизировать дозу облучения и, как следствие, минимизировать  повреждение здоровых тканей.

Рис.2 Методы дифференциальной диагностики НМРЛ и МРЛ

Fig. 2. Methods of differential diagnosis of NSCLC and SCLC

Бронхологическое исследование

Бронхологические исследования (бронхоскопия, эндобронхиальное ультразвуковое исследование (EBUS)) относят к основным и обязательным методам диагностики РЛ. Оно позволяет не только визуально исследовать гортань, трахею и все бронхи, непосредственно увидеть локализацию опухоли, определить границы ее распространения, косвенно судить об увеличении лимфатических узлов корня легкого и средостения, но и провести биопсию для гистологического исследования (тонкоигольная, трепан-биопсия), получить материал (браш-биоптаты, гистологическая биопсия, мазки-отпечатки, соскоб или смыв из бронхиального дерева) для дальнейшего изучения. Однако бронхоскопия имеет существенные ограничения в диагностике предраковых поражений. Эти поражения трудно обнаружить визуально, поскольку они состоят из нескольких слоев клеток толщиной 0,2–1 мм и диаметром в несколько миллиметров  [2, 13, 14].

Гистологическая и иммуногистохимическая диагностика

Гистологическая и иммуногистохимическая (ИГХ) диагностика является основным методом современной дифференциальной диагностики НМРЛ и МРЛ. Гистологические критерии МРЛ включают: мелкие клетки (размер ≈ 2–3 диаметра лимфоцита), мелкозернистый паттерн хроматина в ядре клетки ("соль и перец"), ядерный молдинг, специфические ИГХ-маркеры: CD56, Synaptophysin, Chromogranin A (нейроэндокринная дифференцировка), частая потеря RB1 и TP53 (определяется молекулярно-генетически). Критерии НМРЛ включают: крупные клетки с четкой цитоплазмой, ИГХ-маркеры (аденокарцинома: TTF-1, Napsin A; плоскоклеточный: p40 (более специфичный), p63, CK5/6).

Молекулярно-генетическое тестирование

Молекулярно-генетическое тестирование выполняется для НМРЛ, в том числе при аденокарциноме включает в себя как обязательный минимум: мутации EGFR, ALK, ROS1, BRAF, дополнительно используют KRAS G12C (есть таргетные препараты), MET, RET, HER2.

Результаты определяют тактику лечения, возможность эффективного применения таргетной терапии. В то же время для МРЛ молекулярно-генетическое тестирование рутинно не проводится, поскольку нет утвержденных таргетных препаратов. Тестирование на DLL3 пока не входит в рутинную практику в РФ, но доступно в рамках клинических исследований таргетной терапии (ампуликсимаб).

Таким образом, «золотым стандартом» дифференцировки МРЛ и НМРЛ в условиях клиники является ИГХ, но разработка новых методов диагностики, особенно малоинвазивных и неинвазивных оправданы по нескольким ключевым причинам:

  1. У 15–20% пациентов биопсия недоступна из-за сопутствующих заболеваний или труднодоступной локализации;
  2. Инвазивность и связанные с ней риски: при бронхоскопии существует риск пневмоторакса, кровотечения, трансторакальная биопсия особенно опасна при центральных опухолях или тяжелых состояниях;
  3. Высокая вероятность ложных результатов в связи с некачественным забором материала и фиксацией, а также с гетерогенностью опухоли (биопсия может захватывать ограниченный участок материала и может "пропустить" ключевые мутации);
  4. Возможны ошибки вследствие сложности интерпретации (например, крупноклеточный нейроэндокринный рак может имитировать МРЛ);
  5. Длительное время выполнения анализа: подготовка образца и ИГХ занимает 7–14 дней, а в регионах с дефицитом гистопатологов сроки увеличиваются (при агрессивном МРЛ это критично);
  6. ИГХ выявляет подтип, но не заменяет молекулярный тест и, как следствие, для НМРЛ нужна дальнейшая ПЦР/NGS диагностика.

Эти проблемы создают насущную потребность в разработке альтернативных подходов к дифференциальной диагностике. Особый интерес представляют методы жидкостной биопсии, такие как анализ циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) и внеклеточной ДНК (ctDNA), микроРНК (miRNA), а также применение искусственного интеллекта в обработке радиологических изображений. 

  1. Перспективные неинвазивные альтернативы для дифференциальной диагностики НМРЛ и МРЛ.

Циркулирующие опухолевые клетки 

Дифференциация МРЛ и НМРЛ с помощью циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) основана на том, что МРЛ демонстрирует существенно более высокую концентрацию ЦОК, чем НМРЛ, что позволяет отличать тип опухоли [25]. Количество ЦОК коррелирует с метастатическим потенциалом опухоли, уровнем ангиогенеза и прогнозом пациента [25-27]. Многочисленные исследования подтверждают, что количество ЦОК положительно коррелирует с плохим прогнозом [28, 29].

Выделение и анализ ЦОК с первичной диагностической целью открывает дополнительные функциональные возможности, такие как создание клеточных линий и тестирование чувствительности к терапии in vitro и in vivo, что может стать важным этапом персонализированного лечения. Особый диагностический интерес представляет изучение кластерных ЦОК как индикатора агрессивности и потенциала метастазирования. Известно, что присутствие кластеров ЦОК свидетельствует о высокой метастатической активности, особенно при МРЛ [25].

Современные подходы для детекции ЦОК включают:

  1. Методы на основе эпителиальных маркеров EpCAM [30];
  2. Методы отрицательной селекции (например, CD45) [31];
  3. Микрочиповые технологии (CTC-chip) [32];
  4. Размер-зависимые методы (ISET, ScreenCell, MCA) [33].

Необходимо подчеркнуть, что использование маркеров характеризуется низкой чувствительностью, поскольку позволяет выявлять только часть популяции ЦОК, пропуская EpCAM-отрицательные и мезенхимальные формы при использовании эпителиальных маркеров EpCAM, и CD45-отрицательные клетки при применении CD45-маркера.

Ключевыми проблемами анализа ЦОК для дифференциальной диагностики являются недостаточная стандартизация методов и биологическая гетерогенность ЦОК. Существенную сложность представляет биологическая гетерогенность, где различия между ЦОК-субпопуляциями (например, по степени эпителиальности /мезенхимальности, наличию кластеров) значительно осложняют их точную идентификацию, классификацию и разработку диагностических и прогностических методов на их основе. В настоящее время единственной FDA-одобренной системой для детекции и количественного определения ЦОК в крови остается CellSearch (CELLSEARCH®), тогда как большинство методов требуют дальнейшей разработки и стандартизации [25]. Система CellSearch использует для детекции ЦОК магнитные наночастицы, покрытые антителами к эпителиальному маркеру EpCAM, и одобрена в качестве маркера прогноза выживаемости при метастатическом раке молочной железы, предстательной железы и как маркер прогрессирования при метастатическом колоректальном раке (CELLSEARCH®). 

Таким образом, использование ЦОК для дифференциации МРЛ и НМРЛ представляет собой перспективный, но пока ограниченно применяемый в клинической практике метод. Наиболее обоснованным направлением развития представляется комбинация анализа ЦОК с исследованием циркулирующей внеклеточной опухолевой ДНК  и внедрение новых методов захвата, основанных на физических свойствах или негативной селекции, что позволит учитывать EpCAM-негативные субпопуляции ЦОК и существенно расширить диагностические возможности этого подхода. 

Циркулирующая опухолевая ДНК 

ДНК опухолевых клеток в результате процессов апоптоза, некроза, активной секреции [26] попадает в кровь и другие биологические жидкости, например в слюну, мокроту и т.д., и потенциально является перспективным маркером онкологических заболеваний легких. Многочисленные исследования выявили принципиальные различия в мутационных профилях МРЛ и НМРЛ. Для МРЛ характерна инактивация генов-супрессоров TP53 и RB1 [16, 22], а также взаимоисключающая экспрессия MYCL, MYC или MYCN [16, 34-37]. Эти изменения считаются важнейшими для развития мелкоклеточного фенотипа и тесно связаны с его нейроэндокринной природой. В отличие от МРЛ, НМРЛ демонстрирует более разнообразный спектр генетических изменений, существенно различающийся между гистологическими подтипами. Аденокарциномы легкого, наиболее распространенный вариант НМРЛ, часто несут активирующие мутации в генах EGFR, KRAS, а также перестройки ALK и ROS1 [18-21]. Плоскоклеточный рак, напротив, редко имеет эти изменения, но часто демонстрирует амплификации генов  SOX2, PDGFRA and FGFR1/WHSC1L1, делеции CDKN2A [38, 39] и мутации PIK3CA [40]. Современные методы молекулярной диагностики, такие как секвенирование следующего поколения (NGS) и ПЦР, позволяют с высокой точностью выявлять эти различия. NGS-панели (например, MSK-IMPACT - первый FDA-одобренный комплексный геномный тест для онкологии, разработанный в Memorial Sloan Kettering, анализирует более 400 генов, связанных с раком и используется в клинической практике преимущественно для диагностики и персонализированного лечения солидных опухолей, в том числе НМРЛ [41]) обеспечивают комплексную оценку мутационного статуса, тогда как ПЦР обладает исключительной чувствительностью для обнаружения конкретных мутаций, таких как EGFR и другие. В России уже существуют зарегистрированные NGS-панели для диагностики РЛ, например, от компаний ОнкоАтлас и Хеликон. 

Не менее важны различия в паттернах копийных вариаций (CNV) между МРЛ и НМРЛ. Для мелкоклеточного рака характерны амплификации онкогенов MYC (20% случаев [42]) и SOX2 (27% [37]), а также частые делеции в регионе 3p хромосомы, затрагивающие ген FHIT [43]. Эти изменения ассоциированы с особой агрессивностью течения заболевания. В НМРЛ, напротив, чаще наблюдаются амплификации EGFR и MET 5-15% (при аденокарциноме [44, 45]) или CCND1 (при плоскоклеточном раке [46]), а также делеции CDKN2A [47]. Анализ CNV позволяет не только дифференцировать подтипы РЛ, но и выделять прогностически неблагоприятные варианты, такие как МРЛ с амплификацией MYC [42]. Современные подходы, сочетающие анализ мутационного профиля и копийных вариаций, значительно повышают точность диагностики (на 27%), а использование методов жидкостной биопсии актуально для диагностики МРЛ [48]. Эти данные и способы их получения и анализа уже используют при разработке современных клинических рекомендаций в Америке и Европе, включая руководства NCCN и ESMO.

Метилирование ДНК – это эпигенетическая модификация, при которой к цитозину в CpG-динуклеотидах добавляется метильная группа. Эта модификация оказывает влияние на экспрессию генов путем подавления транскрипции: метилирование промоторных областей блокирует связывание транскрипционных факторов и привлекает белки, уплотняющие хроматин, что "выключает" ген. В патогенезе РЛ нарушения метилирования проявляются двумя противоположными процессами. С одной стороны, наблюдается глобальное гипометилирование, активирующее мобильные генетические элементы и онкогены, что способствует геномной нестабильности. С другой стороны, гиперметилирование промоторных регионов генов-супрессоров опухолевого роста, таких как p16INK4a и BRCA1, приводит к их функциональной инактивации и ускорению пролиферации опухолевых клеток. На сегодняшний день существует большое количество методов анализа статуса метилирования именно внеклеточных ДНК [49], а современные исследования убедительно демонстрируют их диагностическую ценность. Установлено, что различные гистологические подтипы РЛ характеризуются уникальными паттернами метилирования cfDNA, например, анализ генов APC, HOXA9, RARβ2 и RASSF1A способен определить типы РЛ и стадию заболевания [50]. Более того, классификаторы на основе анализа метилирования cfDNA, исследованные в разных работах, позволяли разделять не только виды РЛ между собой [51], но и подтипы МРЛ [52, 53] и НМРЛ [51, 54]. Однако высокая специфичность анализа метилирования отдельных маркеров (часто >80%) в этих работах сопровождается  невысокой чувствительностью (~50–65 %). Решением этой проблемы может стать расширение панелей для одновременного анализа метилирования нескольких маркеров. Кроме использования для диагностических целей, анализ профиля метилирования может быть информативен и для оценки толерантности к терапии [53]. Отдельной проблемой при разработке различных диагностических методов является риск ложноположительных результатов из-за наличия фонового метилирования, особенно у курильщиков [55], что является критически важным в случае РЛ и требует дополнительных исследований. 

Доказательством эффективности использования метилированных маркеров для жидкостной биопсии РЛ является наличие на европейском и китайском рынке нескольких диагностических тестов, направленных на диагностику РЛ – CE-IVD mark [56], и одобренных NMPA China [57],  а также FDA [58].

Таким образом, анализ метилирования cfDNA представляет собой многообещающий инструмент для неинвазивной и специфической диагностики МРЛ и НМРЛ. Тем не менее, требуется дальнейшее развитие в направлении разработки панелей для оценки мультигенного метилирования и автоматизированных платформ анализа, что требует проведения дополнительных валидационных исследований.

Аберрантная экспрессия микроРНК 

МикроРНК рассматриваются как перспективные биомаркеры для дифференциальной онкодиагностики благодаря их стабильности в биологических жидкостях и тканях, а также способности отражать молекулярные особенности опухоли. Многочисленные исследования демонстрируют, что профили экспрессии микроРНК как плазмы крови, так и экзосом в ее составе, существенно различаются при НМРЛ и МРЛ, что открывает новые возможности для разработки неинвазивных диагностических тестов [59, 60]. Действительно, микроРНК встречаются в крови как в свободном виде, так и в составе покрытых мембраной микровезикул [61-65]. Значительную часть микровезикул крови составляют экзосомы – везикулы диаметром 30–150 нм, которые высвобождаются нормальными и опухолевыми клетками и участвуют в межклеточной коммуникации. Экзосомы/микровезикулы опухолевого происхождения содержат белки, нуклеиновые кислоты, липиды, отражающие молекулярный профиль опухоли. Микровезикулы крови являются, по-видимому, более приемлемым источником диагностических микроРНК, чем плазма крови - данные ряда исследований убедительно свидетельствуют в пользу большей обогащенности этого пула микроРНК опухолеспецифическими микроРНК [66].

Большинство исследований посвящено изучению экспрессии микроРНК при НМКЛ и его подтипах, в то время как МРЛ, в связи с его редкостью, уделено недостаточно внимания. Всестороннее исследование экспрессии микроРНК-31 с помощью метода количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в образцах легких после хирургической резекции, в клеточных линиях и в опухолевых ксенотрансплантатах мышей, наряду с имеющимися данными Атласа ракового генома (The Cancer Genome Atlas, TCGA), показало, что микроРНК-31 по-разному экспрессируется в опухолях различных гистологических типов РЛ. В частности, была обнаружена избыточная экспрессия микроРНК-31 в образцах НМРЛ (аденокарциноме легкого, плоскоклеточной карциноме, аденосквамозной карциноме и крупноклеточной нейроэндокринной карциноме), однако в образцах мелкоклеточной карциномы и атипичных карциноидов не наблюдалось увеличения экспрессии [67]. Это позволяет предположить высокий потенциал использования микроРНК-31 в качестве молекулярного маркера гистологических форм РЛ.

В другой работе исследование профилей экспрессии микроРНК в клеточных линиях МРЛ, НМРЛ и в нормальных иммортализованных клетках бронхиального эпителия человека с использованием микрочипового анализа выявило ряд дифференциально экспрессируемых микроРНК. В общей сложности 29 микроРНК были статистически достоверно дифференциально экспрессированы в клеточных линиях МРЛ и НМРЛ, из которых 19 (микроРНК-15a,b, - 16, -195, -135, -106a,b, -101, -338, -1, -98, -103, -107, -17- 5р, -92, -93, -326, -328, -96) были гиперэкспрессированы в клеточных линиях МРЛ по сравнению с НМРЛ, а 10 (микроРНК-21, -22, -23a,b, - 24, -27a, -29a,b,c, -31) – гипоэкспрессированы [68]. Достоверно отличающаяся экспрессия микроРНК при МРЛ по сравнению с НМРЛ и нормальными иммортализованными клетками бронхиального эпителия позволяет предположить, что профили экспрессии микроРНК могут служить диагностическими маркерами опухолей легких.

В другом исследовании была разработана и валидирована панель из восьми микроРНК (микроРНК-106a, -125a-5p, -129-3p, -205, -21, -29b, -375, -7) с использованием патологических и цитологических образцов РЛ. Было установлено, что данная панель, получившая название “miRview lung”, может быть использована для дифференциации МРЛ и НМРЛ (в частности, сквамозной и неквамозной карциномы легкого или карциноида). Исследование проводилось в три этапа: этап обнаружения, на котором были идентифицированы потенциальные биомаркеры; этап разработки анализа, на котором были выбраны маркерные микроРНК и создан классификатор; и этап валидации, на котором диагностический протокол был протестирован на слепой независимой выборке. Общая точность анализа составила 93,7% (95% ДИ, от 90,8% до 95,8%) [69]. Несмотря на оптимистичные результаты, исследование не привело к появлению на рынке диагностической системы для РЛ, что, по-видимому, связано с особенностями аналитической системы или группы доноров и пациентов, вовлеченных в исследование.  

НМРЛ является наиболее распространенным типом РЛ, на который приходится до 85% всех случаев. По этой причине были проведены многочисленные исследования для идентификации микроРНК, которые могут дифференцировать гистологические подтипы НМРЛ, в частности аденокарциному легкого и плоскоклеточный РЛ. Например, в исследовании, основанном на анализе микроРНК крови 90 больных РЛ и 85 здоровых добровольцев, микроРНК-944 показала диагностическую эффективность для оперативного обнаружения плоскоклеточного РЛ (AUC 0,982), тогда как микроРНК-3662 была эффективна для выявления операбельной аденокарциномы легкого (AUC 0,926) [70]. В другом исследовании экспрессии микроРНК в плазме крови была сформирована панель, состоящая из семи циркулирующих микроРНК (микроРНК-9-3p, -96-5p, -147b-3p, -196a-5p, -708-3p, -708-5p, -4652-5p), для диагностики аденокарциномы легкого, а также панель для диагностики плоскоклеточного РЛ, содержащая девять различных микроРНК (микроРНК-130b-3p, -269-3p, -301a-5p, -301b-5p, -744-3p, -760, -767-5p, -4652-5p, -6499-3p) [71].

Обобщая вышесказанное, современные исследования демонстрируют значительный потенциал микроРНК в качестве специфических биомаркеров для дифференциальной диагностики подтипов РЛ. Как показывают данные, уникальные профили экспрессии микроРНК в тканях, плазме крови и экзосомах позволяют достоверно различать НМРЛ и МРЛ с точностью до 93.7% [69]. Особого внимания заслуживают панели микроРНК, эффективно дифференцирующие МРЛ от НМРЛ и разработки на основе анализа циркулирующих микроРНК, открывающие возможности для неинвазивной диагностики [70]. Для стандартизации панелей и их внедрения в клинические лаборатории необходимы дальнейшие многоцентровые исследования с унифицированными протоколами выделения, анализа микроРНК и нормализации полученных данных. Тем не менее, на сегодняшний день микроРНК представляют собой мощный инструмент персонализированной онкологии, способный улучшить точность диагностики и тактику лечения пациентов, больных РЛ.

Белковые маркеры

Современные исследования выделяют несколько классов белков-кандидатов, демонстрирующих дифференциальную экспрессию при МРЛ и НМРЛ. К ним относятся: белки нейроэндокринной дифференцировки (ProGRP, NSE), цитокератины и их фрагменты (CYFRA 21-1), адгезивные молекулы (EpCAM, CEACAM), эмбриональные антигены (CEA), углеводные антигены (CA 125, CA 19-9). Высокий уровень белков нейроэндокринной дифференцировки наблюдается при МРЛ, в то время как другие белковые маркеры повышены при НМРЛ. Так, ProGRP (pro-gastrin-releasing peptide) – один из наиболее специфичных маркеров для МРЛ, связанный с нейроэндокринной природой опухоли. Уровни ProGRP в сыворотке чётко коррелируют с гистологическим типом РЛ: аномальные значения ProGRP выявляются у 60-70% пациентов с локализованной стадией МРЛ и у 75-90% пациентов с распространенной стадией заболевания, в то время как превышение уровня ProGRP в 120 пг/мл наблюдалось только в 4% случаев НМРЛ. Что касается смежных областей применения, по данным многофакторного анализа ProGRP не имеет самостоятельного прогностического значения [72]. Другой белок NSE (neuron-specific enolase) служит высокоспецифичным маркером нейронов и периферических нейроэндокринных клеток. Учитывая его локализацию в определенных тканях в норме, повышение уровня NSE в биологических жидкостях может свидетельствовать о злокачественной пролиферации и иметь диагностическое значение для выявления, стадирования и лечения нейроэндокринных опухолей. NSE чаще повышен при МРЛ, однако его специфичность ниже, чем у ProGRP, из-за возможного повышения при ряде других заболеваний, например, при нейробластоме, меланоме, семиноме и др [73].

Уровни сывороточных биомаркеров, таких как сывороточный амилоид А (SAA) и CYFRA 21-1, повышены при НМРЛ, особенно при плоскоклеточном раке и аденокарциноме, что позволяет использовать их для дифференциации с МРЛ [74]. РЭА (carcinoembryonic antigen) и CEACAM (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule) – чаще ассоциированы с аденокарциномой и другими формами НМРЛ, но могут быть повышены и при МРЛ, что снижает их специфичность. В подробном обзоре имеющихся литературных данных было показано, что сывороточный РЭА обладает самостоятельной прогностической и предиктивной ценностью при НМРЛ независимо от вида лечения, однако его диагностическая ценность незначительна [75]. SCC (squamous-cell carcinoma antigen) – маркер плоскоклеточного рака, одного из подтипов НМРЛ, что делает его полезным для дифференциации с МРЛ. Маркеры CA 125, CA 19-9 и CA 15-3 – исследуются в контексте НМРЛ, особенно аденокарциномы. Было показано, что уровни РЭА, SCC, СА 125, СА 15.3 и TAG-72.3 были значимо выше при НМРЛ относительно МРЛ [76].

Ряд исследований показал, что разные комбинации маркеров, например, ProGRP и NSE, CYFRA21-1 и SCC-Ag,  или РЭА + CYFRA 21-1+SCC/СА 15.3 позволяют значимо увеличить показатели чувствительности и специфичности по сравнению с единичным белком - маркером  [76-78]. Особый диагностический интерес представляет тот факт, что многие из этих маркеров не только отражают гистогенетические особенности опухоли, но и коррелируют с активностью специфических молекулярных путей, что открывает потенциальные возможности для их использования в персонализированных терапевтических стратегиях.

Таким образом, особый интерес для дифференциальной диагностики представляют именно белки, ассоциированные с нейроэндокринной дифференцировкой (ProGRP, NSE) для МРЛ и с эпителиальными опухолями (CYFRA 21-1, CEA и др.) – для НМРЛ. Их детекция в сыворотке крови обладает значительным диагностическим потенциалом, позволяя не только дифференцировать подтипы рака, но и оценивать динамику заболевания в ходе лечения. Однако ни один из известных маркеров не обладает абсолютной специфичностью, что диктует необходимость поиска оптимальных комбинаций и разработки стандартизированных алгоритмов интерпретации.

Экзосомальные белки    

Низкие концентрации опухолеспецифичных белков в сыворотке/плазме крови зачастую не позволяют надежно определять эти белки доступными методами. При этом секретируемые опухолевыми клетками экзосомы (и другие микровезикулы) могут быть сконцентрированы и “отмыты” от балластных белков плазмы крови, белков, выделяемых при лизисе клеток крови, что существенно упростит их последующий анализ. Действительно, было показано, что экзосомальные белки могут быть использованы в диагностике онкологических заболеваний. Например, было показано, что экзосомальные маркеры CD151, CD171 и тетраспанин 8 обладают значительным потенциалом для диагностики онкологических заболеваний легкого в целом [79]. Что касается дифференциальной диагностики типов РЛ, то были получены обнадеживающие результаты, например, интегрин αV экспрессируется в экзосомах раковых клеток обоих типов РЛ, в то время как эпителиально-специфичный гетеродимер интегрина α6β4 был селективно экспрессирован в экзосомах НМРЛ [80]. В то же время, существует лишь небольшое количество сравнительных исследований экзосом больных НМРЛ и МРЛ.  В частности,  было обнаружено, что экспрессия JUNB и CXCR4  повышена в экзосомах больных МРЛ по сравнению со здоровыми донорами, однако осталось неясным, есть ли различия в уровнях экспрессии этих белков в экзосомах  больных НМРЛ [81]. Большая же часть исследований посвящена изучению именно НМРЛ, как наиболее распространенного. Так, Bao с соавторами выявили экзосомальные белки обладающие потенциалом для диагностики, стадирования и прогноза этого заболевания [82]. 

Необходимо отметить, что существует ряд проблем, ограничивающих использование экзосом для диагностики онкологических заболеваний, включая РЛ. Во-первых, используемые методы экстракции и анализа экзосомальных белков разнородны и требуют унификации. Во-вторых, экзосомы, присутствующие в биологических жидкостях, имеют разное происхождение, в том числе и неопухолевое. Такие экзосомы обладают типичным для здоровых клеток набором маркеров, что может осложнять идентификацию маркерных белков. В третьих, большинство моделей построены на небольших, ограниченных выборках и необходимы крупные проспективные исследования, решающие задачу валидации. Таким образом, экзосомальные белки демонстрируют большой потенциал для дифференциальной диагностики, прогнозирования и мониторинга МРЛ и НМРЛ. Однако для оценки их клинического значения необходима разработка стандартизированных протоколов, крупномасштабные многоцентровые исследования и, возможно, включение протеомных данных в мультиомные диагностические системы.

Радиомика

Радиомика (извлечение и анализ данных, полученных из медицинских изображений) - быстро развивающаяся современная область медицины. Разработка надежных систем компьютерной диагностики с использованием искусственного интеллекта (ИИ) уже признана важной частью исследований в медицинской визуализации. Алгоритмы на основе ИИ учатся обрабатывать данные визуализаций с последующей постановкой диагноза. Существует целый ряд исследований, демонстрирующих возможности ИИ в диагностике, стадировании, предикции исходов и субтипировании НМРЛ [83-86] В целом, большинство моделей демонстрируют диагностическую эффективность, сопоставимую или даже превосходящую эффективность экспертов, а общими проблемами являются воспроизводимость и адаптация для использования в клинике  [83]. В то же время, несмотря на активное применение ИИподходов для субтипирования НМРЛ, на решение задачи дифференциальной диагностики МРЛ и НМРЛ с использованием данных КТ/ПЭТ направлено совсем немного исследований [87-89]. Это может быть связано с невысокой частотой встречаемости МРЛ и его быстрым прогрессированием. Особенности клинического течения МРЛ и маршрута диагностики часто приводят к меньшему объёму до-терапевтической визуализации (особенно ПЭТ/КТ), пригодной для радиомического анализа. Это, в свою очередь, объясняет значительную недопредставленность клинически и морфологически подтвержденных случаев МРЛ в публичных и институциональных визуальных ПЭТ/КТ-датасетах. Например, датасет TCIA - NSCLC Radiogenomics dataset [90] включает только случаи немелкоклеточного рака, а в широко используемом LIDC-IDRI [91] отсутствует гистологическая верификация. Таким образом, существует острая необходимость в создании специализированных датасетов МРЛ.

Тем не менее, уже существует несколько коммерческих платформ для решения смежных задач с помощью радиомики, к ним относятся OncoRadiomics (OncoRadiomics SA, построение прогностические модели для НМРЛ), IBEX (IBM Watson Health исследования НМРЛ), Mirada Medical (Canon Medical Systems, построение валидированных моделей для прогноза ответа на иммунотерапию и HealthMyne, создание прогностических моделей для МРЛ).

Таким образом, статистически незначительная доля МРЛ в датасетах и недостаточная стандартизация протоколов визуализации существенно ограничивают возможности развития и валидации ИИмоделей, направленных на неинвазивную дифференциальную диагностику МРЛ и НМРЛ. Тем не менее, отдельные исследования посвященные данной проблеме [87-89, 92] и успехи в смежных областях свидетельствуют о том, что радиомика на основе машинного обучения может быть использована для дифференцировки МРЛ от НМРЛ и других новообразований легкого, а также может быть включена в мультимодальные диагностические системы (например, включающие КТ, ПЭТ, клинические данные, молекулярные маркеры).

Летучие органические соединения

Летучие органические соединения (ЛОС) представляют собой низкомолекулярные (<300 Да) метаболиты, выделяемые опухолевыми клетками в результате измененного метаболизма. Эти соединения (алканы, кетоны, альдегиды, ароматические углеводороды) попадают в кровоток и выделяются через дыхательную систему, что делает их перспективными неинвазивными биомаркерами [93]. Биологическая значимость ЛОС обусловлена их прямой связью с ключевыми онкологическими процессами. Это направление активно развивается, поскольку позволяет выявлять молекулярные паттерны, отражающие различия в метаболизме опухолевых клеток разных типов. Газовая хроматография–масс-спектрометрия (GC-MS) является “золотым стандартом” в исследовании ЛОС. Этот метод позволяет точно идентифицировать индивидуальные летучие соединения. 

Неинвазивные тесты на основе ЛОС разрабатывают и для дифференциальной диагностики МРЛ и НМРЛ  [94]. Были выявлены специфические метаболиты, отличающие ЛОС-профили МРЛ от НМРЛ. Некоторые соединения, такие как алканы, показывают высокую корреляцию с РЛ, что указывает на высокую практичность использования специфических ЛОС для его диагностики [95]. Что касается дифференциального анализа МРЛ и НМРЛ, то тут получены неоднозначные результаты. Так, исследование с использованием ряда клеточных линий показало, что анализ ЛОС и метаболитов позволил достоверно различать РЛ и нормальные клетки, а также МРЛ и НМРЛ, включая различные подтипы НМРЛ. МРЛ отличался от НМРЛ по м- и п-ксиленам, этилбензолу, стиролу, о-ксилену, 1,3-бис(1,1-диметилэтил)-бензолу и 2,4-бис(1,1-диметилэтил)-фенолу и каждое из этих ЛОС имело значение AUC выше 0,95 [96]. В другом исследовании был выполнен анализ ЛОС у пациентов с НМРЛ и МРЛ и здоровых доноров и, хотя он успешно различал больных и здоровых доноров, но не преуспел в дифференцировке подтипов РЛ [97]. Анализ, включающий исследования различий профилей ЛОС между МРЛ и НМРЛ, выявил повышение уровня гексаналя (p < 0.006) при МРЛ [98], однако наблюдаемые различия предположительно были связаны с более высокой злокачественностью и усиленной опухолевой клеточной активностью МРЛ. Таким образом, вопрос о том, насколько эффективно можно дифференцировать МРЛ и НМРЛ на основе ЛОС, остается открытым и нуждается в дальнейшем исследовании.

Перспективный подход к анализу ЛОС - искусственные сенсорные системы или “Электронные носы” (Electronic nose, eNose). eNose - это интегрированная система, имитирующая обоняние, основная задача которой - распознавание и классификация сложных ЛОС смесей; включает в себя сенсорный модуль и систему обработки данных (алгоритмы машинного обучения, метод главных компонент, линейный дискриминантный анализ и др.), которая классифицирует исследуемый “запах”. Сенсорный модуль может использовать различные технологии: газовую хроматографию, газовые сенсоры на основе полупроводников с оксидом металла (MOS), устройства с комбинированными датчиками проводящих полимеров, кварцевого микробаланса (QMB), цветометрических датчиков, химических резисторов и поверхностной акустической волны [99]. “Электронные носы” как правило, не идентифицируют конкретные молекулы, а работают с комплексным «отпечатком» запаха.  Искусственные сенсорные системы быстро анализируют ЛОС-профили выдыхаемого воздуха и используют алгоритмы машинного обучения для классификации типа опухоли. В настоящее время существует лишь ограниченное количество исследований оценивающих эффективность такого «отпечатка» запаха для диагностики больных МРЛ и НМРЛ. При этом были получены обнадеживающие результаты, свидетельствующие, что чувствительность/специфичность дифференциальной диагностики МРЛ и НМРЛ с помощью eNose составляет 87% [100]. Несмотря на оптимистичные данные в этой области, еще предстоит решить ряд  проблем, в числе которых, например, влияние неустановленных факторов на точность детекции ЛОС, вклад индивидуальных особенностей пациентов на специфичность диагностики. Например, ЛОС, характерные для РЛ, могут выделяться и при хроническом бронхите или хронической обструктивной болезни легких [101]. Кроме того, важный вклад в концентрацию ЛОС вносят индивидуальные вариации, поскольку метаболизм ЛОС зависит от возраста, пола, диеты, курения и микробиома ротовой полости [102, 103]. ЛОС-анализ на основе eNose - это перспективный инструмент для неинвазивной дифференцировки МРЛ и НМРЛ, особенно для разработки скрининговых тестов, поскольку позволяет выполнить быстрый, неинвазивный анализ, однако его чувствительность и специфичность требуют масштабных и глубоких исследований. 

  1. Заключение

Современная дифференциальная диагностика МРЛ и НМРЛ переживает период активной трансформации, переходя от традиционных инвазивных методов к комплексным неинвазивным подходам. Несмотря на бесспорную значимость ИГХ как золотого стандарта, его ограничения стимулируют развитие принципиально новых диагностических стратегий.

Перспективные направления, включая анализ циркулирующих опухолевых клеток, внеклеточной ДНК, экзосомальных маркеров, микроРНК и ЛОС, демонстрируют значительный диагностический потенциал. Параллельно развиваются методы радиомики и искусственного интеллекта, открывающие новые возможности в обработке медицинских изображений и мультиомных данных. Однако переход этих технологий в клиническую практику сталкивается с рядом методологических и практических сложностей. Ключевыми остаются вопросы стандартизации, воспроизводимости и валидации новых методов. При этом дифференциальная диагностика редких и агрессивных форм рака, таких как МРЛ, представляет собой особую сложность.

Будущее дифференциальной онкодиагностики, несомненно, принадлежит мультимодальным методам, интегрирующим достижения жидкостной биопсии, радиомики и искусственного интеллекта в единые диагностические алгоритмы. Именно синергия различных диагностических подходов позволит преодолеть ограничения отдельных методов и достичь нового уровня точности. Для ее достижения важную роль в обработке многомерных данных сыграют современные алгоритмы, включая метод главных компонент, линейный дискриминантный анализ, метод случайного леса, метод опорных векторов и нейронные сети (в том числе глубокое обучение). Комплексный подход к диагностике РЛ с учетом индивидуальных характеристик больных откроет новые возможности и для персонализированного лечения, что в конечном итоге позволит существенно улучшить качество и длительность жизни пациентов.

 

Дополнительная  информация

 

Вклад авторов. М.Ю. Коношенко – концептуализация обзора, обработка литературы, подготовка текста обзора; П.П. Лактионов – концептуализация и редактирование текста; Брызгунова О.Е. – редактирование текста, подготовка таблиц, написание раздела "молекулярные маркеры рака легкого"; Шутко Е.В. – написание раздела "микроРНК маркеры рака легкого"; А.А. Илющенко, Я.М. Данилова, С.Д. Горбунков – написание раздела "клиническая диагностика рака легкого", К.А. Зыков – методическая поддержка, техническая редакция обзора. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Author contribution. M.Y. Konoshenko – concept of the review, literature analyses, writing the manuscript; P.P. Laktionov – manuscript critical revision, editing; O.E. Bryzgunova – editing, preparation of tables, writing the “molecular markers of lung cancer” chapter; E.V. Shutko – writing the “miRNA markers of lung cancer” chapter; A.A. Ilyushchenko, Y.M. Danilova, S.D. Gorbunkov – writing the “clinical diagnosis of lung cancer” chapter; K.A. Zykov – methodological   support, technical  editing  of  the  review. The authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

 

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках ГЗ №388-03-2024-136 ФГБУ «НИИ Пульмонологии» ФМБА России и при поддержке ГЗ №125012900932-4 ФГБУ ИХБФМ СО РАН.

Funding source. The study was funded by the Russian state-funded project for the FBSI "Research Institute of Pulmonology" of the FMBA of Russia (grant number 388-03-2024-136) and supported by the Russian state-funded project for ICBFM SB RAS (grant number 125012900932-4).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. 

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

×

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Эко-Вектор,

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 38032 от 11 ноября 2009 года.