Бактерии рода bacillus как перспективные продуценты протеолитических ферментов

Texto integral

Обоснование. В настоящее время протеазы используются во многих областях промышленности: в фармацевтической, пищевой, а также в медицине. Около 60 % коммерчески доступных ферментов производится бактериями рода Bacillus, чаще всего видом Bacillus subtilis. Также бактерии Bacillus обладают высокой приспособляемостью к различным условиям [1]. Разработка технологии получения ферментных препаратов важна с точки зрения обеспечения продовольственной безопасности и независимости государства. Поэтому исследования в данном направлении являются актуальными и практически значимыми.

Цель — изучить возможность использования бактерий Bacillus subtilis в качестве продуцента протеолитических ферментов.

Методы. В качестве объекта исследования использовали клетки бактерий Bacillus subtilis. Штамм был получен в коллекции культур ВКПМ [2]. На первом этапе работы микроорганизмы оживляли в жидкой питательной среде L, а затем пересевали на скошенный агар. Состав питательной среды L (г/л): пептон — 15; дрожжевой экстракт — 15; NaCl — 5; агар микробиологический — 15.

Для учета биомассы использовали гравиметрический метод и оценку по мутности клеточной суспензии с использованием спектрофотометра. Для большей точности методы объединили и построили градуировку по биомассе. Определяли оптическую плотность разведений клеточной суспензии и концентрацию биомассы, полученную весовым методом, а затем по этим значениям строили градуировочный график. Для построения графика использовали диапазон с оптической плотностью от 0,1 до 1, так как для этого диапазона сохраняется линейность закона Бугера–Ламберта–Бера [3]. Полученные результаты представлены на рис. 1.

Рис. 1. График для определения концентрации биомассы по оптической плотности клеточной суспензии

Для обработки данных использовали программу машинного обучения Weka и модель линейной регрессии, для проверки использовали метод K-блочной кросс-валидации.

Для определения активности протеаз выбрали метод, основанный на интенсивности окрашивания тирозина, отщепляющегося от белка в процессе гидролиза протеазами. За основу методики брали модификацию ГОСТ 34430-2018 «Метод определения протеолитической активности», в качестве субстрата использовали раствор альбумина бычьего сывороточного [4].

На рис. 2 представлена кривая роста концентрации клеток и активности фермента. Измерения проводили каждые 12 часов в течение 5 суток.

Рис. 2. Зависимость концентрации биомассы клеток бактерий и протеолитической активности культуральной жидкости от времени культивирования

Также исследовали характер роста биомассы и протеолитической активности фермента на питательных средах, содержащих соли аммония: (NH4)2HPO4 и цитрат аммония — (NH4)3C6H5O7. Затем провели культивирование бактерий в шейкере-инкубаторе при 37 °С и 160 об/мин на питательной среде с использованием органического источника азота — пептона. Спустя сутки клеточную суспензию центрифугировали для отделения культуральной жидкости с ферментом и после ее выпарили на ротационно-вакуумном испарителе для удаления воды и сушки фермента. В полученном сухом ферменте определили активность и сравнили с активностью промышленно выпускаемых ферментов.

Результаты. Получена модель зависимости концентрации биомассы от оптической плотности клеточной суспензии. Коэффициент корреляции для полученной модели составляет 96 %, а значение средней абсолютной ошибки — 2 %. Максимальный прирост биомассы и ферментативная активность наблюдались через 24 ч после начала культивирования. Прирост биомассы на среде L с пептоном ниже, но значение протеолитической активности выше, а на средах с солями аммония, наоборот, значение ферментативной активности уменьшается, так как бактерии в первую очередь усваивают неорганические источники азота и необходимость в биосинтезе протеаз отсутствует.

Выводы. В ходе работы был разработан метод контроля концентрации клеток по оптической плотности культуральной жидкости; отработана методика определения протеолитической активности. Также был получен сухой ферментный препарат, обладающий уровнем активности, сопоставимым с промышленными аналогами.

Sobre autores

Autor responsável pela correspondência
Email: elena.tsareva.978@mail.ru

студентка, группа 2-ВБШ-23ВБШ-101М, Высшая биотехнологическая школа

Bibliografia

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares

Ação

1. JATS XML

Baixar

2. Рис. 1. График для определения концентрации биомассы по оптической плотности клеточной суспензии

Baixar (68KB)

Metadados

3. Рис. 2. Зависимость концентрации биомассы клеток бактерий и протеолитической активности культуральной жидкости от времени культивирования

Baixar (91KB)

Metadados